Alexandre dos Santos Cristino

alexsc@ime.usp.br
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Extração de RNA

- colocar tecido/organismo em 500ul de trizol
- vortex (rompe tecido)
- spin alguns segundos
- deixar 5 min em temp. ambiente
- acrescentar clorofórmio 200ul/ml de trizol (caixa roxa geladeira)
- agitar rigorosamente por 15 seg
- incubar 2-3 min temp ambiente
- centrifugar por 15 min - 12.000 rpm a 4oC
- transferir o RNA sobrenadante (superior) para novo tubo eppen
- acrescentar álcool isopropílico 500ul/ml trizol
- incubar em temp ambiente por 10min
- centrifugar por 10 min - 12.000 rpm a 4oC
- lavar o RNA com 1ml de etanol 75%
- agitar para resuspender
- o RNA extraído e mantido em etanol pode ser guardado por até 1 ano
- centrifufar por 5 min - 12.000 rpm a 4oC
- retirar o álcool
- banho seco a 55oC por 10 min
- dissolver o pellet de RNA com água DEPC (20-30 ul). A partir deste momento o RNA esta sendo degradado!

Verificar integridade do RNA extraído

Quantificar concentração de RNA extraído
Configurações da máquina:
- path length = 10
- fator RNA = 40
- Comprimento de onda = 260nm

Preparar amostras para leitura:
- branco -> 60ul H2O
- RNA -> 1ul + 59ul H20

Converter para [] ug/ul
- (fator_RNA(ug/ml) * fator_diluicao(H20/RNA)) * D.O. = [RNA]ug/ul